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技術(shù)原理

   CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出現(xiàn)的一種由sgRNA指導(dǎo)Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術(shù)。在這一系統(tǒng)中，sgRNA引導(dǎo)序列靶定位點剪切雙鏈DNA達到對基因組DNA 進行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠?qū)π∈蠡蚪M特定基因位點進行精確編輯，目前瑞思元已經(jīng)成功將此技術(shù)應(yīng)用于小鼠基因敲除/敲入模型制備，以及條件性敲除（Loxp系統(tǒng)）模型制備。      

      目前瑞思元采取優(yōu)化過的野生型Cas9和雙切口Cas9n（Optimized Cas9 System,OCAS and OCASn）。采用優(yōu)化過的雙切口Cas9n(OCASn)可以將脫靶效應(yīng)降到最低。

常規(guī)基因敲入

利用CRISPR/Cas9基因敲入技術(shù)，針對靶基因設(shè)計、構(gòu)建相應(yīng)的gRNA質(zhì)粒和donor質(zhì)粒，通過Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重組，引入特定的突變、報告基因（如EGFP、mCherry、RFP、LacZ等）或需要表達的功能性cDNA（如cre、Dre等）到目的基因的特定位點。

條件性基因敲入

利用CRISPR/Cas9基因敲入技術(shù)，針對靶基因設(shè)計、構(gòu)建相應(yīng)的gRNA質(zhì)粒和donor質(zhì)粒，將外源基因或特定突變敲入引入到基因組目的基因的特定位點。

Rosa26位點定點敲入

     根據(jù)Rosa26基因序列設(shè)計合成sgRNA，將構(gòu)建包含同源序列和目的序列的片段與Cas9、sgRNA共同顯微注射入受精卵中，Cas9/sgRNA復(fù)合體與基因組靶序列結(jié)合并切割雙鏈DNA，以含目的片段的同源序列為模版修復(fù)基因組DNA，最終獲得在Rosa26基因intron中定點插入片段的大小鼠。

制備流程

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